Иммуноферментный анализ, ИФА (Enzyme immunoassay)

Иммуноферментный анализ, ИФА (Enzyme immunoassay)— метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями.

Для определения антигенов и антител применяются твердофазный (гетерогенный) вариант иммуноферментного анализа. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител обладает следующими преимуществами:

высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

• возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;
• стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);
• простотой проведения реакции;
• наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;
• возможностью автоматизации всех этапов реакции
• относительно низкой стоимостью диагностических наборов.

Вышеперечисленные преимущества определили широкое применение ИФА во всех областях медицины, в том числе и при диагностике, профилактике и изучении вирусных гепатитов . Диагностические препараты для ИФА, предназначенные для выявления большинства серологических маркеров инфицирования вирусами гепатитов А, В, С и D выпускаются различными предприятиями и фирмами как у нас в стране, так и за рубежом. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических препаратов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики [фирмы “ДИА-плюс”, “Рош” (“ROCHE”), “ЭББОТТ” (“АВВОТТ”)]. Основные требования, предъявляемые к твердой фазе при проведении ИФА, включают:

• устойчивость к растворам, используемым в реакции;
• наличие высокой специфической емкости, т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов.

Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, когда часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы. В настоящее время разработаны различные варианты твердофазного иммуноферментного анализа, и практически все они были апробированы или применены для выявления маркеров инфицирования вирусами гепатитов А, В, С, D и Е.

Наиболее простой схемой проведения ИФА является “сэндвич”-метод. Общая схема проведения метода заключается в следующем. На твердой фазе адсорбированы антитела к исследуемому антигену После инкубации исследуемого материала и образования комплекса антитело — антиген проводится удаление несвязавшихся компонентов, добавляется коньюгат, т. е. антитела к искомому антигену, меченые ферментом. По завершении инкубации с последующим удалением непрореагировавшего коньюгата промывкой образуется комплекс, в котором антиген как бы заключен между двумя слоями антител. Наличие меченных ферментом антител определяется при помощи соответствующего субстрата. “Сэндвич”-метод используется для выявления HBsAg, HBeAg, антигена вируса гепатита А. Для ускорения “сэндвич”-метода, применяется его модификация — “одностадийный сэндвич-метод”, при которой добавление исследуемого материала и коньюгата проводится одновременно. Так, для выявления HBsAg фирма “ДИАплюс” предлагает эту схему проведения реакции.

При использовании диагностических наборов ИФА, основанных на этой схеме проведения реакции, необходимо помнить, что в исследуемом образце не должно быть веществ, ингибирующих активность фермента, т. н. ферментных ядов, (например, азида натрия, применяемого в качестве консерванта). Одной из особенностей этого метода является снижение оптической плотности ферментативной реакции с образцами, имеющими крайне высокую концентрацию исследуемого антигена за счет образования комплекса HBsAg и коньюгата в растворе. Однако тщательный подбор концентрации меченых антител в коньюгате представляемого диагностического набора устраняет возможность получения ложнонегативных результатов с образцами, имеющими высокую концентрацию HBsAg. Для выявления антител к различным антигенам вирусов гепатитов А, В, С и D применяются разнообразные варианты постановки ИФА, основными из которых являются:

• Метод с использованием меченых вторичных антител (антител против иммуноглобулинов человека) и иммобилизированных антигенов на твердой фазе. Метод применяется для определения антител к вирусу гепатита С. Общая схема проведения реакции заключается в следующем: на твердой фазе иммобилизуют антиген, после инкубации исследуемого материала и удаления несвязавшихся компонентов добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам человека класса IgG, которые взаимодействуют с Fc-фрагментом анти-ВГС. После проведения субстрат-ферментативной реакции проводят учет полученных результатов. При наличии антител уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных образцов. Для уменьшения возможных неспецифических реакций вводится специальный коэффициент, указанный в наставлениях, прилагаемых к диагностическим наборам.
• Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованного на твердой фазе антигена. Метод используется для выявления анти-HBs в диагностическом наборе “AUSAB” EIA фирмы “ЭББОТТ”. Общая схема проведения реакции заключается в следующем: на полистироловом шарике адсорбирован HBsAg субтипа ad и ау, после инкубации с исследуемым материалом и удаления непрореагировавших компонентов добавляется HBsAg, меченный ферментом, который взамодействует со свободными центрами связывания антител к HBsAg, провзаимодействовавшими с антигеном, сорбированным на твердой фазе. При наличии антител в исследуемой пробе уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных контрольных образцов.
• Метод с использованием меченых и иммобилизованных антител, а также стандартного антигена. Этот вариант метода применяют для выявления анти-HBs и анти-НВе с диагностикумами фирмы (“ДИАплюс”). Общая схема проведения реакции заключается в следующем: на первом этапе реакции исследуемый образец смешивают с раствором, содержащим фиксированное количество антигена. После завершения инкубации добавляют шарик с сорбированными на нем антителами и коньюгат. После удаления непрореагировавших компонентов реакции проводится ферментативная реакция, интенсивность которой обратно пропорциональна содержанию исследуемых антител в образце. Вариантом этой схемы может служить определение анти-НВе и анти-дельта с диагностикумами фирмы “ЭББОТТ”, когда компоненты реакции добавляются последовательно.
• Метод с использованием меченых антител и иммобилизованного антигена (конкурентный метод). Данная схема широко применяется для выявления анти-HBs, анти-НВс и анти-ВГА. Общая схема проведения реакции заключается в следующем: к антигену, иммобилизованному на твердой фазе одновременно добавляют исследуемый материал и коньюгат. При проведении реакции меченые и исследуемые антитела конкурируют за активные центры антигена, иммобилизованного на твердой фазе. После завершения инкубации и удаления не прореагировавших компонентов проводится ферментативная реакция, результаты которой обратно пропорциональны количеству антител в исследуемом образце. При использовании набора фирмы (“ДИАплюс”) при выявлении анти-HBs, в случае наличия HBsAg уровень ферментативной реакции будет превосходить результаты реакции в негативных образцах, что позволяет косвенно судить о наличии антигена.
• Метод выявления антител класса IgM - многослойный “сэндвич” метод. Этот метод применяется для выявления анти-НВс IgM и анти-ВГА IgM. Общая схема проведения реакции заключается в следующем: на твердой фазе адсорбированы антитела к мю-цепям иммуноглобулинов класса М, которые взаимодействуют с антителами класса IgM, находящимися в исследуемой сыворотке. После удаления непрореагировавших компонентов добавляется стандартное количество антигена, антитела против которого определяются. Удалив непрореагировавшие компоненты реакции, добавляют меченые антитела, реагирующие с антигеном. Также, как и в обычном “сэндвич”-методе, чем больше количество антител, тем интенсивней ферментативная реакция. Для уменьшения ложнопозитивных результатов исследование сывороток крови проводится после их разведения в 1000 раз.

Вышеперечисленные схемы проведения реакций по определению антигенов и антител не исчерпывают всего многообразия вариантов проведения иммуноферментной реакции. Разработаны варианты ИФА с использованием авидин-биотиновой системы, систем усиления ферментативной реакции, проведения реакции на фильтрах и т. д.

Для ферментативной метки антигенов или антител могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза, бета-галактозидаза и т. д. Во всех коммерческих тест-системах используется пероксидаза хрена, выбор которой определяется ее высокой удельной каталитической активностью, доступностью, стабильностью, простотой детекции. В качестве субстратного реагента наиболее часто применяется орто-фенилендиамин (ОФД) с перекисью водорода, продукт окисления которого регистрируется фотометрически. Для остановки ферментативной реакции применяют “стоп реагент”, который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве “стоп реагента” применяют серную кислоту. Учет результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 490 нм.

Одним из наиболее важных вопросов при проведении иммуноферментного теста является вопрос о специфичности результатов. Для подтверждения позитивных результатов при выявлении HBsAg применяется подтверждающий или конфирмационный тест. Четкое соблюдение всех параметров, указанных в наставлениях к диагностическим наборам для иммуноферментного анализа, позволяет избежать ложнопозитивных и ложнонегативных результатов, связанных с работой оператора.